中藥資源是中藥産業發展的(de)基礎，中藥資源研究方法正逐步形成以分(fēn)子生物(wù)學、生物(wù)信息學及計算(suàn)機科學等爲主要研究手段的(de)多(duō)學科交叉體系。衆所周知，中藥方劑化(huà)學成分(fēn)複雜(zá)，難以找到單一作用(yòng)靶點，闡明(míng)可(kě)能的(de)藥理(lǐ)，而轉錄組學可(kě)以對(duì)藥物(wù)幹預機體的(de)分(fēn)子變化(huà)進行多(duō)維度、多(duō)靶點的(de)描繪，以彌補單基因研究的(de)不足，全面揭示藥理(lǐ)機制，從而爲方藥有效成分(fēn)的(de)篩選、新藥的(de)發現以及優良種質資源的(de)培育奠定基礎，爲中西醫結合治療提供數據支撐。

近日，真邁生物(wù)的(de)合作單位紹興市婦幼保健院在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》雜(zá)志上發表了(le)題爲“Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) replication and antigen expression byBrucea javanica(L.) Merr. oil emulsion”的(de)研究成果。該研究結合分(fēn)子生物(wù)學實驗及高(gāo)通(tōng)量測序證實：鴉膽子（Brucea javanica(L.) Merr.）油乳劑（BJOE）對(duì)人(rén)乙型肝炎病毒（HBV）的(de)複制和(hé)抗原表達存在明(míng)顯的(de)抑制作用(yòng)，且這(zhè)種作用(yòng)是通(tōng)過上調白細胞介素6（IL-6）實現的(de)，揭示了(le)其潛在的(de)抗病毒機理(lǐ)。基于真邁生物(wù)GenoLab M高(gāo)通(tōng)量基因測序平台對(duì)BJOE處理(lǐ)前後的(de)肝癌細胞系HepG2進行轉錄組測序，進一步确定BJOE對(duì)肝癌細胞中IL-6基因的(de)影(yǐng)響。本研究爲BJOE的(de)HBV臨床治療潛力提供了(le)新的(de)見解，也(yě)說明(míng)對(duì)于真實樣本的(de)轉錄組測序，GenoLab M表現依然優秀，獲得(de)學術界的(de)認可(kě)。

*以下(xià)爲該研究成果解讀

背景簡介

乙型肝炎病毒（HBV) 感染是目前全球最主要的(de)健康衛生問題之一，慢(màn)性HBV感染是導緻肝硬化(huà)、肝衰竭及肝細胞癌發生的(de)重要原因。據世衛組織統計：2019年，全球有2.96億人(rén)患有慢(màn)性乙肝感染，且每年有150萬新發感染者，對(duì)公共安全造成很大(dà)威脅。HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，包括三種重要的(de)免疫标記物(wù)，也(yě)是HBV病毒組裝的(de)三個(gè)重要組成成分(fēn)：HBsAg（乙肝表面抗原），HBeAg（乙肝e抗原），HBcAg（乙肝核心抗原）。目前，抗HBV治療藥物(wù)主要有兩類：α幹擾素（IFN-α）和(hé)核苷類似物(wù)NAs（如lamivudine：中文名拉米夫定，簡稱LMV）。前者通(tōng)過直接抗病毒、免疫調節和(hé)抗增殖作用(yòng)發揮抗病毒活性；後者通(tōng)過模拟生理(lǐ)核苷，靶向HBV逆轉錄酶，有效抑制病毒DNA複制。但是，由于耐藥突變的(de)不斷出現、病毒載量的(de)提高(gāo)及血清中轉氨酶的(de)增加，會導緻抗HBV藥物(wù)的(de)療效顯著降低。因此，HBV治療仍然面臨巨大(dà)的(de)挑戰。

鴉膽子是盛産于我國南(nán)方的(de)一種中藥材，味苦、性寒、微毒，被報道對(duì)多(duō)種疾病具有良好的(de)治療效果，包括癌症、瘧疾、痢疾及胃潰瘍等。鴉膽子種子提取的(de)重要成分(fēn)，具有顯著的(de)抗植物(wù)病毒活性。然而，鴉膽子是否能抗HBV，如能，這(zhè)種抗性的(de)機制又是怎樣的(de)呢(ne)？目前尚無報道。本文通(tōng)過大(dà)量的(de)體外實驗，研究鴉膽子油乳劑對(duì)HBV體外複制、抗原表達及細胞因子分(fēn)泌的(de)作用(yòng)，證實其對(duì)乙型肝炎的(de)臨床治療潛力，并闡明(míng)其可(kě)能的(de)抗病毒作用(yòng)機制。

結果概要

01 研究框架

本研究使用(yòng)三種肝癌細胞系：Huh7，HepG2以及HepG2.2.15（由HepG2改造而來(lái)，可(kě)以穩定表達HBV亞複制子和(hé)病毒抗原），Huh7和(hé)HepG2體外轉染HBV-WT（野生型）或HBV-LMV-MT（抗拉米夫定突變型）複制子質粒以實現HBV的(de)穩定複制和(hé)抗原表達。使用(yòng)不同劑量的(de)BJOE處理(lǐ)細胞，通(tōng)過細胞活性檢測、qRT-PCR（實時(shí)熒光(guāng)定量PCR）、CMIA（化(huà)學發光(guāng)微粒子免疫測定）、Western Blot（蛋白免疫印迹）、FCM（流式細胞術）以及RNA-seq（轉錄組測序）等技術手段，确定BJOE的(de)抗HBV作用(yòng)機制。

02 BJOE對(duì)細胞活力的(de)影(yǐng)響

該研究首先檢測在不同的(de)劑量濃度和(hé)時(shí)間梯度下(xià)，BJOE對(duì)肝癌細胞活力的(de)影(yǐng)響，以确定合适的(de)BJOE使用(yòng)濃度，用(yòng)于後續抗病毒實驗，以避免BJOE對(duì)細胞産生毒性作用(yòng)。通(tōng)過CCK-8實驗（細胞增殖和(hé)細胞毒性檢測）證實（Figure 1E-G）：BJOE≤5 mg/ml，作用(yòng)時(shí)間24小時(shí)和(hé)48小時(shí)，均不會造成肝癌細胞活力的(de)明(míng)顯改變，故後續研究中BJOE使用(yòng)的(de)最大(dà)濃度爲5 mg/ml。

随後，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng)BJOE處理(lǐ)HepG2.215，以及轉染HBV-WT的(de)HepG2和(hé)Huh7細胞。通(tōng)過qRT-PCR檢測發現，與拉米夫定抑制病毒複制的(de)結果類似，BJOE可(kě)以有效降低HBV的(de)複制水(shuǐ)平，尤其在5 mg/ml使用(yòng)濃度時(shí)，約40%的(de)HBV複制被抑制（Figure 2A-C）。CMIA檢測細胞上清中HBsAg和(hé)HBeAg，Western Blot檢測HBcAg表達水(shuǐ)平，結果表明(míng)：三種乙肝病毒抗原在BJOE處理(lǐ)後，都呈現明(míng)顯的(de)下(xià)調，而拉米夫定對(duì)HBV抗原表達沒有影(yǐng)響（Figure 2D-H）。

通(tōng)過FCM檢測BJOE處理(lǐ)後肝癌細胞上清中細胞因子的(de)水(shuǐ)平，發現BJOE顯著增強HepG2和(hé)Huh7細胞中IL-6的(de)分(fēn)泌，但在HepG2.215細胞中，作用(yòng)并不明(míng)顯（Figure 3）。爲進一步驗證BJOE、IL-6和(hé)HBV的(de)關系，對(duì)轉染HBV-WT質粒的(de)HepG2和(hé)Huh7細胞分(fēn)别使用(yòng)BJOE和(hé)DMSO（二甲基亞砜）處理(lǐ)，檢測上清中細胞因子的(de)水(shuǐ)平，結果表明(míng)：DMSO顯著下(xià)調IL-6的(de)水(shuǐ)平，與其促進病毒複制的(de)作用(yòng)一緻；而BJOE顯著上調IL-6的(de)水(shuǐ)平，結合上述BJOE抑制HBV複制和(hé)抗原表達的(de)結果，我們推測BJOE通(tōng)過上調IL-6從而發揮抗病毒作用(yòng)（Figure 4A-B）。研究人(rén)員(yuán)爲驗證上述推測，對(duì)HBV-WT轉染的(de)HepG2和(hé)Huh7細胞，外源加入重組IL-6後，發現兩種細胞中HBV的(de)複制及抗原表達均被明(míng)顯抑制，說明(míng)IL-6的(de)上調可(kě)以直接抑制HBV的(de)轉錄和(hé)複制，而這(zhè)種上調是BJOE刺激引起的(de)（Figure 4C-D）。

爲進一步探討(tǎo)BJOE對(duì)肝癌細胞中IL-6轉錄水(shuǐ)平的(de)影(yǐng)響，研究人(rén)員(yuán)對(duì)BJOE處理(lǐ)的(de)HepG2細胞進行了(le)轉錄組測序。結果表明(míng)：BJOE導緻HepG2細胞中IL-6基因上調，且IL-6作爲關鍵基因，在細胞内與多(duō)種基因存在相互作用(yòng)。在GO富集通(tōng)路中，IL-6廣泛參與肝髒相關的(de)生物(wù)學過程，包括肝細胞增殖和(hé)形态發生，以及肝髒功能實現（Figure 5）。

HepG2/Huh7細胞轉染HBV-WT或HBV-LMV-MT質粒後，使用(yòng)BJOE或拉米夫定處理(lǐ)細胞，然後通(tōng)過qRT-PCR及FCM檢測HBV的(de)複制及抗原表達。結果表明(míng)，5 mg/ml BJOE可(kě)以有效抑制WT和(hé)LMV-MT的(de)複制，以及HBV抗原的(de)表達；而LMV僅對(duì)WT有效，對(duì)突變型無效。當兩者聯合使用(yòng)時(shí)，抗病毒效應被加強（Figure 6）。

爲進一步探討(tǎo)鴉膽子單一成分(fēn)的(de)抗HBV作用(yòng)，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng)鴉膽子苦醇（brusatol）、鴉膽子堿A（bruceine A）、鴉膽子堿B（bruceine B）、鴉膽亭（bruceantin）和(hé)鴉膽子苦味素（bruceantinol）分(fēn)别處理(lǐ)HepG2和(hé)Huh7細胞後，檢測上清中細胞因子的(de)水(shuǐ)平，結果表明(míng)：鴉膽子堿B可(kě)以上調IL-6的(de)水(shuǐ)平（Figure 7A-B），且在HepG2.215中有效抑制HBV複制和(hé)抗原表達（Figure 7C）。

基于上述分(fēn)析，我們得(de)出如下(xià)結論：

1、BJOE可(kě)以有效抑制HBV複制及病毒抗原表達；

2、BJOE可(kě)以調節IL6的(de)分(fēn)泌，進而發揮抗病毒作用(yòng)；

3、BJOE不僅對(duì)WT病毒發揮有效的(de)抗病毒作用(yòng)，對(duì)LMV-MT病毒同樣有效；

4、在BJOE抗HBV作用(yòng)中，其活性成分(fēn)--鴉膽子堿B發揮關鍵作用(yòng)。