近日，真邁生物(wù)與合作單位華中農業大(dà)學農業微生物(wù)學國家重點實驗室在Journal of Applied Microbiology上發表了(le)題爲“Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis”的(de)研究成果。該研究基于GenoLab M高(gāo)通(tōng)量基因測序儀完成了(le)堿性蛋白酶的(de)高(gāo)産菌株Bacillus licheniformis AQ在50 L發酵罐全過程（8個(gè)時(shí)間段）的(de)轉錄組測序以解析其高(gāo)表達堿性蛋白酶機制。在發酵終點（48 h)時(shí)，堿性蛋白酶達到峰值（42,020 U/mL），其他(tā)時(shí)間點與這(zhè)個(gè)時(shí)間點比較，得(de)到各組差異表達基因。随後取其各組差異表達基因的(de)交集，得(de)到61個(gè)基因，對(duì)它們的(de)功能分(fēn)析發現：這(zhè)些基因的(de)編碼蛋白主要參與了(le)分(fēn)解代謝過程、肽酶和(hé)抑制劑、伴侶和(hé)折疊催化(huà)等過程。
堿性蛋白酶(AprE)是一種重要的(de)工業酶，廣泛應用(yòng)于食品加工、洗滌劑工業、皮革業、生物(wù)轉化(huà)反應、廢物(wù)處理(lǐ)、生物(wù)活性肽合成等領域。在全球範圍内，AprE占據了(le)50%以上的(de)酶産業。然而，目前的(de)AprE産量仍然不能滿足工業需求，導緻了(le)大(dà)規模工業酶短缺。因此，進一步提高(gāo)AprE産率具有廣闊的(de)工業應用(yòng)前景。很多(duō)微生物(wù)都能合成AprE，而其中芽孢杆菌屬Bacillus具有明(míng)顯優勢，它們屬于公認安全菌株，其蛋白分(fēn)泌能力強，易于培養，發酵周期短，工業發酵穩健性強，基因修飾方便，例如B. licheniformis，可(kě)以敲除調控因子sig F，阻止芽孢形成，使得(de)AprE的(de)酶活提升20%，達到29,494 ± 1053 U/mL。安琪酵母股份有限公司擁有一株高(gāo)産AprE的(de)菌株，B. licheniformis AQ，本次采集了(le)50 L大(dà)罐發酵的(de)8個(gè)重要時(shí)間點樣本測定了(le)AprE的(de)酶活等理(lǐ)化(huà)指标，并提取RNA完成轉錄組測序。
01 AprE發酵過程中的(de)基因表達模式
該研究的(de)8份樣本轉錄組測序，一共得(de)到242 M高(gāo)質量reads，檢測到3821個(gè)基因在發酵過程中表達，占菌株總基因的(de)91.74%。顯然，發酵終點(48 h)時(shí)高(gāo)表達基因最多(duō)(a)。由于AprE酶活在發酵終點(48 h)時(shí)最高(gāo)，因此，以48 h作爲對(duì)照(zhào)，進行差異表達基因（DEG）分(fēn)析，24 h時(shí)DEG數目最多(duō)，其次是32 h(b)。七個(gè)比較組的(de)DEG的(de)交集一共涉及61個(gè)基因(c)。通(tōng)過功能富集分(fēn)析發現這(zhè)61個(gè)基因主要參與生物(wù)過程，尤其是氨基酸、α -氨基酸、有機酸、有機氮化(huà)合物(wù)等衆多(duō)分(fēn)解代謝過程(d)。而肽酶和(hé)抑制劑、伴侶蛋白和(hé)折疊催化(huà)(KEGG)和(hé)胞外區(qū)域(GO_Cellular component)等功能富集最爲顯著。DEG中最多(duō)的(de)功能是肽酶和(hé)抑制劑。高(gāo)效的(de)蛋白分(fēn)泌和(hé)折疊是芽孢杆菌重組蛋白生産的(de)關鍵。這(zhè)些過程由轉運系統的(de)組分(fēn)以及細胞内和(hé)胞質外的(de)伴侶蛋白輔助完成。這(zhè)部分(fēn)富集分(fēn)析結果也(yě)證實了(le)在AprE發酵過程中分(fēn)泌和(hé)折疊活性非常活躍。
02 AprE發酵過程中的(de)潛在調控網絡
研究人(rén)員(yuán)查閱文獻，并結合轉錄組測序結果，一共挑選了(le)30個(gè)蛋白，它們可(kě)能與AprE合成相關，通(tōng)過與STRING數據庫進行分(fēn)析，繪制PPI（蛋白相互作用(yòng)）網絡，最終得(de)到了(le)22個(gè)蛋白的(de)網絡信息。Spo0A位于中心，擁有節點數最多(duō)(11個(gè))，其次是CodY (9個(gè))、sigH (9個(gè))和(hé)ArbB (8個(gè))。而這(zhè)些蛋白的(de)編碼基因表達量熱(rè)圖顯示，AprE基因的(de)表達量在24 h達到峰值，随後下(xià)降，在32 h達到第二高(gāo)峰，随後下(xià)降，發酵結束時(shí)略有上升。右下(xià)5個(gè)sigma因子的(de)表達模式與AprE略有不同。
03 qRT-PCR驗證轉錄組表達量
研究人(rén)員(yuán)挑選了(le)與AprE合成相關的(de)20個(gè)關鍵基因進行qRT-PCR驗證，包括芽孢形成的(de)16個(gè)調控基因，4個(gè)全局調控基因。qRT-PCR數據顯示：大(dà)多(duō)數基因在32 h時(shí)表達水(shuǐ)平較高(gāo)。而轉錄組數據顯示大(dà)部分(fēn)基因在24 h時(shí)表達水(shuǐ)平較高(gāo)，但未檢測到qRT-PCR數據。雖然qRT-PCR與RNA-seq數據存在一定差異，但大(dà)部分(fēn)基因的(de)表達趨勢是一緻的(de)，證明(míng)了(le)轉錄組數據的(de)可(kě)靠性。
1. 該研究首先考察了(le)B. licheniformis AQ在工業發酵過程中不同時(shí)間點堿性蛋白酶的(de)變化(huà)。結果表明(míng)，發酵過程中堿性蛋白酶不斷積累，在發酵48 h時(shí)達到最大(dà)值；
2. 發酵全過程的(de)轉錄組測序結果顯示：表達量最高(gāo)的(de)基因在發酵結束時(shí)(48 h)最多(duō)；
3. 構建了(le)潛在的(de)PPI網絡，并利用(yòng)qRT-PCR技術對(duì)AprE發酵過程中關鍵基因的(de)表達水(shuǐ)平進行了(le)驗證。
Ji A, Zheng X, Yang W, et al. Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2023: lxad319.