近日，湖州學院生命科學學院浙江省水(shuǐ)産資源保護與開發重點實驗室在 （Aquaculture IF 4.5）發表題爲“Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in Macrobrachium rosenbergii with exogenous calcium supplement in water ”的(de)研究成果。爲研究外源補鈣對(duì)羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)脫皮的(de)影(yǐng)響，該研究采用(yòng)25 mg/L、85 mg/L、145 mg/L和(hé)205 mg/L梯度鈣濃度的(de)水(shuǐ)對(duì)羅氏沼蝦進行培養試驗。結果表明(míng)，145 mg/L濃度組的(de)累積脫皮率最高(gāo)。145 mg/L濃度組在脫皮前和(hé)脫皮後均表現出較高(gāo)的(de)脫皮相關酶(谷氨酰胺合成酶、β- n -乙酰氨基葡萄糖酶和(hé)幾丁質酶)活性。145 mg/L組與對(duì)照(zhào)組相比，外骨骼外表皮密度增大(dà)，鞘内增厚，上皮細胞形态呈柱狀;基于GenoLab M高(gāo)通(tōng)量測序平台的(de)轉錄組測序結果顯示，一些差異基因在溶酶體和(hé)鈣信号等通(tōng)路中顯著富集。同時(shí)，145 mg/L劑量組脫皮相關基因維甲酸X受體、蛻皮激素受體、鈣調磷酸酶等基因的(de)表達水(shuǐ)平顯著升高(gāo)。在205 mg/L濃度下(xià)，羅氏沼蝦Na⁺/K⁺ ATP酶α亞基的(de)表達受到抑制，影(yǐng)響其蛻皮。綜上所述，在水(shuǐ)中适量補充鈣可(kě)以促進羅氏沼蝦的(de)蛻皮和(hé)外骨骼礦化(huà)。該研究爲甲殼類水(shuǐ)産養殖中外源補鈣提供了(le)理(lǐ)論依據。

蛻皮是甲殼類海洋生物(wù)生命周期中重要的(de)生理(lǐ)過程，對(duì)甲殼類海洋生物(wù)的(de)生長(cháng)發育、繁殖和(hé)肢體再生具有重要作用(yòng)。這(zhè)一過程的(de)特點是一系列形态學變化(huà)，主要包括蛻皮期間(C)、蛻皮前(D)、蛻皮(E)和(hé)蛻皮後(AB)階段。甲殼類動物(wù)的(de)外骨骼主要由碳酸鈣組成，鈣的(de)來(lái)源是食物(wù)、水(shuǐ)和(hé)體内儲存。然而，飼料中的(de)鈣含量不能滿足甲殼類動物(wù)蛻皮的(de)需要。因此，在水(shuǐ)中添加外源鈣已成爲甲殼類水(shuǐ)産養殖的(de)普遍做(zuò)法。人(rén)們普遍認爲，在水(shuǐ)中适量補充外源鈣可(kě)以促進甲殼類脫殼。但目前外源鈣補充對(duì)甲殼類動物(wù)蛻皮影(yǐng)響的(de)分(fēn)子機制尚不清楚。

01 轉錄組揭示不同鈣濃度下(xià)肝胰髒基因表達

爲了(le)闡明(míng)不同鈣濃度下(xià)羅氏沼蝦換殼的(de)遺傳調控機制，該研究對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺樣本進行了(le)RNA-seq分(fēn)析。差異分(fēn)析表明(míng)， 145 mg/L組大(dà)多(duō)數差異基因上調(圖1B)。145 mg/L組 VS 25 mg/L組、85 mg/L組 VS 145 mg/L組中鑒定的(de)差異基因數量大(dà)約是85 mg/L組 VS 25 mg/L組、205 mg/L組 VS 25 mg/L組、145 mg/L組 VS 205 mg/L組比較中鑒定的(de)差異基因數量的(de)2倍(圖1C)。在5個(gè)比較組中，共有18、19、17、24和(hé)22個(gè)KEGG通(tōng)路被顯著富集，如MAPK信号通(tōng)路(ko04010)和(hé)Wnt信号通(tōng)路(ko04310)。代謝途徑(ko01100)是兩兩比較中檢測到的(de)共有通(tōng)路，除145 mg/L組和(hé)205 mg/L組比較外，4組均檢測到溶酶體信号通(tōng)路。有趣的(de)是，鈣信号通(tōng)路(ko04020)和(hé)溶酶體通(tōng)路(ko04142)在85 mg/L組和(hé)145 mg/L組的(de)比較中被顯著富集(圖1D)，鈣信号通(tōng)路在205 mg/L組和(hé)25 mg/L組的(de)比較中也(yě)被顯著富集。

圖1 兩兩比較羅氏沼蝦4組間差異表達基因的(de)數量

02 轉錄組揭示外源補鈣對(duì)蝦蛻皮調控關鍵基因

爲了(le)進一步篩選出蛻皮調控的(de)關鍵候選基因，該研究對(duì)溶酶體和(hé)鈣信号通(tōng)路中的(de)差異基因進行了(le)篩選和(hé)聚類(圖2A)。聚類分(fēn)析表明(míng)，145 mg/L組與其他(tā)組相比具有特定的(de)基因表達模式，205 mg/L組的(de)基因表達趨勢與對(duì)照(zhào)組相似。145 mg/L組鞘磷脂磷酸二酯酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B單鈣轉運蛋白和(hé)腺嘌呤核苷酸轉位酶等基因的(de)表達水(shuǐ)平在中上調，而外源性類固醇調節樣蛋白的(de)表達受到抑制。溶酶體途徑中的(de)ERP抑制蛻皮激素的(de)産生。此外，鞘磷脂磷酸二酯酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B等基因位于溶酶體通(tōng)路的(de)關鍵節點，其表達水(shuǐ)平上調會調節溶酶體中的(de)鈣通(tōng)道(圖3)。

爲了(le)揭示4組的(de)基因表達動态，使用(yòng)TCseq對(duì)所有差異進行表達趨勢分(fēn)析，并根據4組的(de)基因表達趨勢選擇兩個(gè)聚類(圖3B)。聚類1顯示1461個(gè)差異基因聚集在一起，145 mg/ L組基因表達量最高(gāo)。KEGG富集分(fēn)析表明(míng)，差異基因在“氧化(huà)磷酸化(huà)”(ko00190)中顯著富集。随著(zhe)鈣濃度的(de)升高(gāo)，簇2整體呈上升趨勢。KEGG富集分(fēn)析顯示，基因主要富集于“Rap1信号通(tōng)路”(ko04015)和(hé)“FoxO信号通(tōng)路”(ko04068)。

圖3 參與溶酶體和(hé)鈣信号通(tōng)路的(de)差異基因熱(rè)圖

1. 本文研究了(le)不同鈣濃度水(shuǐ)中羅氏沼蝦蛻皮頻(pín)率、蛻皮相關酶、外骨骼礦化(huà)和(hé)轉錄調控的(de)變化(huà)。研究發現，适量的(de)外源補鈣可(kě)以促進羅氏沼蝦的(de)蛻皮和(hé)外骨骼礦化(huà)；

2. RNA-seq分(fēn)析表明(míng)，适當的(de)鈣濃度可(kě)抑制蛻皮抑制激素（MIH）和(hé) fushitarazu factor 1 (ftz-f1) 的(de)表達水(shuǐ)平，從而介導MIH信号通(tōng)路下(xià)遊基因的(de)表達，影(yǐng)響羅氏沼蝦的(de)蛻皮過程；

3. 水(shuǐ)中鈣含量過高(gāo)會抑制ATPase alpha subunit (atpa) 的(de)表達，影(yǐng)響羅氏沼蝦的(de)蛻皮。這(zhè)些發現有助于理(lǐ)解鈣調控羅氏沼蝦蛻皮的(de)分(fēn)子機制。

Ding, Li, et al. "Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in Macrobrachium rosenbergii with exogenous calcium supplement in water." Aquaculture 586 (2024): 740761.