腺病毒（Human adenoviruses，HAdVs) 是人(rén)呼吸道感染常見的(de)病原體之一，可(kě)引起廣泛的(de)臨床疾病，包括肺炎、支氣管炎、膀胱炎、眼結膜炎、胃腸道疾病及腦(nǎo)炎等，在兒(ér)童及免疫功能缺陷患者中症狀尤其嚴重。HAdVs基因型别衆多(duō)，且不同型别間或同一型别内均可(kě)發生重組，導緻新的(de)毒株産生，對(duì)公共衛生安全産生極大(dà)的(de)影(yǐng)響。傳統對(duì)HAdVs的(de)診斷及分(fēn)型主要依賴病毒分(fēn)離培養、血清學及關鍵衣殼蛋白（capsid）基因的(de)PCR鑒定，費時(shí)費力，且對(duì)中和(hé)抗體等試劑依賴程度很高(gāo)。基于mNGS的(de)病原微生物(wù)診斷，可(kě)以直接對(duì)臨床樣本中的(de)核酸進行高(gāo)通(tōng)量測序，而不依賴微生物(wù)的(de)分(fēn)離和(hé)培養，能夠快(kuài)速、客觀地檢測臨床樣本中所有未知的(de)病原微生物(wù)，已成爲感染性疾病精準診斷的(de)重要工具。此外，通(tōng)過對(duì)mNGS序列進行病原體基因組組裝，可(kě)以在基因組和(hé)基因層面對(duì)病原體進行深入的(de)探究。

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研究框架

本研究于2018~2019年，在湖北(běi)省鹹甯市某醫院收集400例流感樣上呼吸道感染患者的(de)鼻咽拭子樣本，對(duì)常見呼吸道病毒病原體進行篩查後，确定21例HAdVs陽性患者，共獲得(de)25份樣本（包含4例病毒分(fēn)離培養樣本）。随後，将這(zhè)25個(gè)樣本分(fēn)别使用(yòng)GenoLab M及NextSeq 550平台進行宏基因組測序和(hé)相關分(fēn)析。

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mNGS組裝完整性及準确性評估

本研究首先對(duì)所有下(xià)機數據進行測序質量評估，确定GenoLab M及NextSeq 550平台均可(kě)獲得(de)可(kě)靠的(de)mNGS測序數據。随後對(duì)測序reads進行de novo組裝，并評估了(le)組裝的(de)完整度及準确性。結果表明(míng)：①在組裝完整性方面（指标：contig數量, N50, N90, 最大(dà)contig長(cháng)度，覆蓋度），兩平台基本一緻；②在組裝準确性方面（指标：組裝的(de)基因組與參考基因組的(de)比對(duì)率），GenoLab M平台88% (22/25)的(de)樣本，NextSeq 550平台84% (21/25)的(de)樣本，獲得(de)了(le)＞90%的(de)比對(duì)率。說明(míng)兩平台組裝的(de)基因組準确性均較高(gāo)，可(kě)以進行後續基因組特征的(de)分(fēn)析。

Table1 GenoLab M與NextSeq 550組裝參數表

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平台間mNGS物(wù)種注釋結果比較

研究人(rén)員(yuán)對(duì)兩個(gè)平台的(de)mNGS數據進行了(le)物(wù)種注釋，發現檢出的(de)微生物(wù)種類及豐度高(gāo)度一緻，且HAdVs含量豐富。臨床樣本相對(duì)病毒分(fēn)離培養的(de)樣本，檢出的(de)微生物(wù)種類更爲複雜(zá)。SE75（圖1B）模拟測序與SE150（圖1A）測序獲得(de)一緻的(de)物(wù)種注釋結果，說明(míng)在基于mNGS的(de)HAdVs感染診斷中，測序時(shí)間更短的(de)SE75模式同樣适用(yòng)，可(kě)以實現更快(kuài)速的(de)病原體診斷。

圖1 mNGS物(wù)種注釋結果比較

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HAdVs基因型分(fēn)類及進化(huà)樹分(fēn)析

該研究對(duì)25個(gè)測序樣本進行了(le)HAdVs分(fēn)型，共鑒定得(de)到7種HAdVs基因型：HAdV-B3 (n=9)，B7 (n=1)，B55 (n=2)；HAdV-C1 (n=2)，C2 (n=6)，C5 (n=1)；以及HAdV-E4 (n=4)。結果表明(míng)，在湖北(běi)鹹甯地區(qū)，HAdV基因型多(duō)樣性較高(gāo)，且以B3, C2和(hé)E4爲主。不同的(de)基因型聚類爲不同的(de)進化(huà)分(fēn)支，同一基因型的(de)不同分(fēn)離株聚類爲同一分(fēn)支。

圖2 HAdVs基因型分(fēn)類及進化(huà)樹分(fēn)析

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不同基因型的(de)全基因組進化(huà)樹分(fēn)析

爲進一步探討(tǎo)不同型别的(de)分(fēn)離株與已發現的(de)參考毒株的(de)進化(huà)關系，研究人(rén)員(yuán)對(duì)HAdV-B，C，E毒株分(fēn)别進行了(le)全基因組進化(huà)分(fēn)析。結果表明(míng)：①新鑒定的(de)分(fēn)離株與對(duì)應的(de)參考毒株形成預期的(de)聚類，且與當地廣泛流傳的(de)毒株進化(huà)關系密切；②B3基因型已開始形成新的(de)聚類分(fēn)支，需加強流行病學監測；③S64、S71和(hé)S28分(fēn)離株經重組及全基因組比對(duì)分(fēn)析，确定爲重組毒株。

圖3 不同基因型全基因組進化(huà)樹分(fēn)析

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核苷酸一緻性和(hé)多(duō)樣性分(fēn)析

全基因組核苷酸一緻性分(fēn)析表明(míng)，HAdVs不同型别間具有較高(gāo)的(de)進化(huà)保守性，HAdV-B, C和(hé)E基因組一緻性分(fēn)别達到93.52%，97.49%和(hé)96.99%。三個(gè)關鍵capsid基因——penton，hexon和(hé)fiber的(de)多(duō)樣性分(fēn)析表明(míng)：penton基因在HAdV-C中更爲保守，在HAdV-B中多(duō)樣性很高(gāo)，且存在兩個(gè)明(míng)顯的(de)高(gāo)變區(qū)；hexon基因在HAdV-B和(hé)C中多(duō)樣性更高(gāo)，同樣存在兩個(gè)高(gāo)變區(qū)，形成中和(hé)抗體識别的(de)表位；fiber基因在三種基因型中，多(duō)樣性都很高(gāo)，其C端的(de)γ表位參與血凝抑制，決定病毒的(de)組織偏好性（嗜性）。

圖4 病毒全基因組及關鍵capsid基因核苷酸一緻性及多(duō)樣性分(fēn)析

基于上述分(fēn)析，我們得(de)出如下(xià)結論：

1、mNGS可(kě)以應用(yòng)于臨床樣本HAdVs的(de)快(kuài)速診斷；

2、通(tōng)過de novo組裝可(kě)以得(de)到完整的(de)病毒基因組，其準确性及完整度滿足後續基因層面的(de)分(fēn)析要求；

3、新鑒定的(de)HAdV-B3分(fēn)離株形成明(míng)顯的(de)新聚類，且與北(běi)京株親緣關系密切，提示區(qū)域傳播的(de)可(kě)能；

4、本次檢測到3個(gè)HAdV重組病毒株，屬于HAdV-B55及HAdV-C2基因型；

5、Capsid基因存在高(gāo)核苷酸多(duō)樣性和(hé)高(gāo)頻(pín)的(de)重組事件，提示在中國進行HAdV流行病學監測的(de)必要性。