近日，真邁生物(wù)與合作單位上海交通(tōng)大(dà)學醫學院附屬第一人(rén)民醫院在Frontiers in Genetics的(de)Genomic Assay Technology版塊上發表了(le)題爲“Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers”的(de)研究成果。該研究涵蓋了(le)兩種腫瘤panel：TSO500和(hé)TargetSeq One；三種典型樣本：FFPE，cf DNA（cell-free DNA） 和(hé)cell line；六個(gè)主流的(de)NGS測序平台：NovaSeq 6000，NextSeq 550，MGISEQ 2000，GenoLab M，FASTASeq 300，SURFSeq 5000；五種常用(yòng)的(de)突變分(fēn)析軟件：HaplotypeCaller，Mutect2，SiNVICT，SNVer和(hé)VarScan 2。

靶向基因組測序(TS)是一種有效的(de)高(gāo)通(tōng)量測序(NGS)方法，重點關注與疾病發病機制或臨床相關的(de)一組基因或靶點。它通(tōng)過快(kuài)速檢測基因變異，爲臨床醫生提供參考，幫助他(tā)們解釋病人(rén)基因圖譜，并爲實施個(gè)性化(huà)的(de)抗癌提供建議(yì)，極大(dà)地促進了(le)腫瘤精準化(huà)的(de)發展。

TSO500是一個(gè)全面的(de)靶标測序panel，涵蓋超過8種癌症類型和(hé)523種癌症相關基因(1.94 Mb)，用(yòng)于捕獲FFPE标準品HD832，而TargetSeq One kit 用(yòng)于富集Twist cf DNA。本研究中，6個(gè)乳腺癌和(hé)卵巢癌的(de)cell line的(de)panel數據來(lái)自于公開數據庫SRA。

TSO500靶向測序平台與軟件間的(de)比較

如圖1a和(hé)1b所示，NovaSeq 6000，NextSeq 550，GenoLab M和(hé)FASTASeq 300四個(gè)測序平台在SNP和(hé)InDel檢測的(de)靈敏度（sensitivity）方面表現出幾乎一緻的(de)結果，雖然SiNVICT和(hé)Mutect2在InDel的(de)calling上有一些細微差異。FASTASeq 300測序儀基于SNVer和(hé)VarScan2軟件，可(kě)以檢出樣本中全部的(de)SNP和(hé)InDel突變（sensitivity=100%）。對(duì)于F-score和(hé)精确度（precision），SNVer和(hé)VarScan2在SNP和(hé)InDel檢測上也(yě)表現最好。此外，與ddPCR驗證的(de)真集相比，四個(gè)測序平台一緻性都比較高(gāo)，特别是使用(yòng)SNVer和(hé)VarScan2兩個(gè)分(fēn)析工具(1c）。

Pearson相關系數(r)熱(rè)圖(圖1d)顯示，在相同的(de)軟件下(xià)，不同測序平台呈現出相似的(de)整體性能。随後，研究者比較了(le)不同測序平台與分(fēn)析軟件間高(gāo)置信度變異的(de)檢測數量(圖1e)，發現所有數據集的(de)一緻性高(gāo)達93.4%(198/212)。其中，FASTASeq 300能檢測到更多(duō)的(de)特有突變，特别是通(tōng)過SNVer和(hé)VarScan2兩個(gè)軟件。

綜上，在SNP和(hé)InDel的(de)突變檢出方面，分(fēn)析軟件間比測序平台間表現出的(de)差異更大(dà)，FASTASeq 300在SNVer和(hé)VarScan2軟件下(xià)表現更優。

一般而言，測序深度的(de)增加有助于變異檢測結果的(de)重現和(hé)低頻(pín)突變的(de)檢出，但需要更長(cháng)的(de)分(fēn)析時(shí)間、更高(gāo)的(de)計算(suàn)複雜(zá)度以及成本。研究者以突變檢出表現最好的(de)FASTASeq 300測序平台和(hé)SNVer以及VarScan2兩款軟件爲研究重點，比較了(le)不同測序深度下(xià)變異檢測時(shí)間、内存使用(yòng)、SNP和(hé)InDel檢測靈敏度的(de)差異，期望探索到保證高(gāo)靈敏度的(de)情況下(xià)所需的(de)最低測序深度(圖1f和(hé)1g，結果表明(míng)：至少500x的(de)測序深度可(kě)以保證全部突變的(de)檢出，而VarScan2軟件消耗内存更少，運行時(shí)間更短）。

TargetSeq One捕獲的(de)cf DNA測序平台與分(fēn)析軟件的(de)比較

對(duì)于cf DNA樣本，軟件SNVer和(hé)VarScan2在SNP和(hé)InDel檢測方面表現出色。F-score, 召回率（recall）和(hé)精确度都接近100% (Fig. S2)，三個(gè)測序平台NovaSeq 6000，MGISEQ 2000和(hé)SURFSeq 5000結果也(yě)很一緻。

cell line樣本的(de)分(fēn)析軟件比較

通(tōng)過下(xià)載公開數據集，研究者獲取到3個(gè)乳腺癌和(hé)3個(gè)卵巢癌的(de)panel測序結果，并使用(yòng)上述五款軟件進行突變檢測，結果表明(míng)：SNVer和(hé)VarScan2兩款軟件同樣表現更優，其檢測結果最接近真集。

不同測序平台在同一個(gè)分(fēn)析軟件下(xià)，突變檢測的(de)一緻性較好。三種類型的(de)腫瘤樣本，在突變檢測方面，SNVer和(hé)VarScan2均表現最優。該項研究爲腫瘤靶向測序提供了(le)一個(gè)benchmark。該研究使用(yòng)五種軟件對(duì)三種典型的(de)腫瘤樣本進行變異檢測的(de)性能評估，也(yě)爲未來(lái)腫瘤變異研究提供了(le)有價值的(de)參考。

Feng B, Lai J, Fan X, et al. Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers[J]. Frontiers in Genetics, 2023, 14: 1293974.