近日，浙江大(dà)學醫學院附屬婦産科醫院生殖遺傳科董旻嶽主任團隊和(hé)真邁生物(wù)合作，在Nature 子刊Laboratory Investigation （JCR Q1 醫學：研究與實驗）在線發表題爲“Non-invasive Prenatal Screening for Common Fetal Aneuploidies by Single Molecular Sequencing”的(de)研究成果，該論文基于真邁生物(wù)GenoCare 1600單分(fēn)子基因測序儀開展了(le)477例孕婦樣本的(de)無創産前篩查NIPS，T13，T18，T21的(de)敏感性均爲100%，整體特異性也(yě)接近100%。
背景介紹
無創産前篩查Non-invasive Prenatal Screening (NIPS)，是基于孕婦外周血對(duì)胎兒(ér)染色體非整倍性進行篩查的(de)一種方式，主要用(yòng)于T13、T18和(hé)T21的(de)檢測。目前最常用(yòng)的(de)技術手段是NGS測序。單分(fēn)子測序不使用(yòng)PCR，理(lǐ)論上可(kě)以去除PCR引入的(de)GC偏向。在本研究中，我們對(duì)比了(le)NGS測序平台NextSeq 550和(hé)單分(fēn)子測序平台GenoCare 1600在NIPS的(de)測序性能。
結果概要
圖1 入組孕婦的(de)孕周分(fēn)布圖
477名孕婦的(de)孕周分(fēn)布爲12周-25周+6，峰值在19-20周。195例爲高(gāo)齡孕婦（>35歲），占比40.9%（圖1），T21，T18和(hé)T13的(de)陽性例數爲107，30和(hé)6例。
GenoCare 1600在NIPS的(de)整體表現
測序數據過濾後，平均每例樣本獲得(de)5.3±1.1 M unique reads，平均讀長(cháng)爲36.3±1.4 nt。梯度截取不同的(de)數據量(1.5 M，2.0 M，2.5 M，3.0 M和(hé)3.5 M以上reads)，以探究檢測結果所需的(de)最少reads數目，結果發現（圖2）：
1. 僅需2 M reads，T13和(hé)T18的(de)敏感度（sensitivity）即可(kě)達到100%，而T21需要3.5M以上reads才能達到；
2. 整體特異性（specificity），随著(zhe)數據量的(de)增加而增加，在3.5M時(shí)，達到最大(dà)值97.31%；
3. 2 M reads時(shí)，整體的(de)陰性預測值（NPV）和(hé)T21的(de)陽性預測值（PPV），均接近100%；
4. 數據量大(dà)于3.5M時(shí)，T18和(hé)T13的(de)陽性預測值（PPV），達到峰值，分(fēn)别爲99.07%和(hé)46.15%。
圖2 不同測序數據量下(xià)的(de)T13，T18，T21的(de)檢測結果
5. 基于Z值的(de)結果和(hé)羊水(shuǐ)穿刺後胎兒(ér)染色體核型結果，T13和(hé)T21分(fēn)别有6例和(hé)1例假陽性檢測結果（圖3）。
圖3 染色體13，18和(hé)21的(de)Z score分(fēn)布
6. 基于227例男(nán)胎評估胎兒(ér)濃度的(de)檢測限，發現正常孕婦的(de)胎兒(ér)濃度低于3%，而T21和(hé)T18的(de)最低胎兒(ér)濃度是3.47%和(hé)4.31%（圖4）。
圖4 單分(fēn)子測序NIPS的(de)胎兒(ér)濃度分(fēn)布
GenoCare 1600與NextSeq 550在NIPS的(de)測序性能對(duì)比部分(fēn)樣本（對(duì)照(zhào)n=22，T21 n=6， T18 n=2， T13 n=1）同時(shí)采用(yòng)NextSeq 550做(zuò)NIPS檢測，計算(suàn)Z值和(hé)GC偏向性ΔRGC2。結果顯示（圖5）：
1. 單分(fēn)子測序T21，T18的(de)Z值分(fēn)布分(fēn)别爲6.44–12.52，9.46–24.77，而NGS測序T21，T18的(de)Z值分(fēn)布分(fēn)别爲3.47–7.52和(hé)6.65–21.20，單分(fēn)子測序與對(duì)照(zhào)界限的(de)區(qū)分(fēn)更加明(míng)顯。
2. 單分(fēn)子測序的(de)GC偏向性ΔRGC2顯著低于NGS測序(P<0.001)。
圖5 單分(fēn)子測序與NGS測序性能對(duì)比（a）Z score分(fēn)布 （b）GC偏向性比較
討(tǎo)論與結論
1、GenoCare 1600與NextSeq 550測序儀相比，操作更爲簡便，手工操作2小時(shí)，全流程一天内完成；
2、相對(duì)于NGS測序，單分(fēn)子測序無需PCR，GC偏向性更低，實驗操作更少，對(duì)實驗室空間要求更低；
3、檢索近3年全球基于NGS測序的(de)大(dà)人(rén)群隊列NIPS的(de)研究文獻，發現T13，T18和(hé)T21的(de)陽性預測值分(fēn)布0-84.4%，54.84-91.2%，和(hé)79.23-100%，單分(fēn)子測序的(de)表現更好；
結 論
因全流程無PCR引入GC偏向，單分(fēn)子測序儀GenoCare 1600可(kě)全方面提升NIPS性能，而其簡單的(de)文庫構建方式，可(kě)以縮短項目交付周期和(hé)降低檢測成本，今後更多(duō)樣本的(de)檢測數據會有助于繼續提升分(fēn)析算(suàn)法的(de)準确性。