在此次新冠病毒疫情的(de)發現和(hé)防控當中，包括基因測序、RT-PCR在内的(de)病原檢測技術做(zuò)出了(le)有目共睹的(de)貢獻，也(yě)接受了(le)前所未有的(de)壓力和(hé)挑戰。這(zhè)篇文章(zhāng)總結了(le)病原核酸檢測在此次疫情中發揮的(de)作用(yòng)，以及個(gè)人(rén)對(duì)病原測序行業未來(lái)的(de)一些思考。

1、新冠病毒的(de)發現

毋庸置疑，基因測序技術在此次新冠病毒的(de)發現中起了(le)非常關鍵的(de)作用(yòng)。

首先，複旦大(dà)學張永振團隊從一位病人(rén)的(de)肺泡灌洗液樣本中提取病毒，通(tōng)過二代測序準确地測定了(le)病毒的(de)基因序列，上傳到GenBank，并指出了(le)它和(hé)SARS病毒的(de)相似度（Wu et al, “A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”）。

接著(zhe)，中科院武漢病毒所石正麗團隊通(tōng)過對(duì)5個(gè)病人(rén)樣本的(de)測序判定病毒和(hé)來(lái)自蝙蝠的(de)BatCoV RaTG13病毒序列更爲相近，但和(hé)SARS病毒有同樣的(de)ACE2 cell entry receptor。同一團隊設計出了(le)正确的(de)qPCR檢測方法（Zhou et al, “Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin”）。這(zhè)爲迅速判定疫情和(hé)對(duì)病人(rén)确診打下(xià)了(le)基礎。

此後，中國疾控中心譚文傑團隊使用(yòng)三種測序方法（Lu et al, “Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”)分(fēn)析了(le)病毒的(de)變異位點和(hé)進化(huà)樹。

至此，我國科研單位在差不多(duō)一個(gè)月(yuè)之内迅速發現了(le)正确的(de)緻病病毒并完成測序，和(hé)全世界分(fēn)享了(le)病毒的(de)序列和(hé)已知變異，給出了(le)有效的(de)核酸檢驗方法。這(zhè)些工作都得(de)到了(le)各國政府和(hé)世界衛生組織WHO的(de)高(gāo)度評價。

Mapped read count plot showing the coverage depth per base of the WHCV genome

(Wu et al, 'A new coronavirus associated with human respiratory disease in China')

在這(zhè)些發現新冠病毒的(de)工作中發揮出色的(de)是mNGS（metagenomics next generation sequencing，宏基因組測序）技術。發現新病原的(de)關鍵在于高(gāo)通(tōng)量和(hé)準确率。因爲新病原在樣本中的(de)豐度和(hé)序列未知，因此爲從大(dà)量的(de)背景核酸中判定新病毒數據，必須要有足夠的(de)reads數來(lái)支持生信分(fēn)析。

從複旦張永振團隊的(de)文章(zhāng)可(kě)以看出，爲了(le)拿到未知病毒120K準确的(de)Reads，整個(gè)metagenomics測序通(tōng)量達到了(le)50M以上(多(duō)餘DNA序列來(lái)自人(rén)和(hé)其它微生物(wù))。從前面的(de)圖示還(hái)可(kě)以看到病毒測序的(de)覆蓋率不均勻，這(zhè)個(gè)現象很可(kě)能和(hé)逆轉錄或擴增偏好有關，這(zhè)無疑更加提升了(le)數據量要求和(hé)序列組裝的(de)難度。高(gāo)準确率的(de)重要性對(duì)de novo測序毋需多(duō)言。在沒有準确reference提供比對(duì)依據的(de)時(shí)候，原始數據的(de)準确率對(duì)組裝至關重要。二代測序優秀的(de)通(tōng)量和(hé)準确率在此得(de)到充分(fēn)的(de)體現。

對(duì)于三代測序或單分(fēn)子測序而言，其優勢在于通(tōng)過減少擴增來(lái)達到更均勻的(de)基因組覆蓋和(hé)更真實的(de)病原豐度排序。病人(rén)樣品裏的(de)病毒RNA豐度非常有限，而且RNA在樣本儲存，提取和(hé)逆轉錄過程中會進一步損失。因此現在所有的(de)mNGS測序方法都必須經過兩次擴增：第一步是cDNA文庫PCR， 第二步是測序前的(de)RPA/RCA擴增或橋式PCR。病原單分(fēn)子測序工作隻需要文庫制備後的(de)擴增，對(duì)cDNA的(de)擴增也(yě)必須優化(huà)以盡量減少偏好性。國内的(de)科研機構和(hé)科技企業已經在積極開發針對(duì)新冠病毒測序的(de)三代測序方案，其中包括中國疾控中心的(de)Nanopore測序方案，真邁生物(wù)基于GenoCare測序儀的(de)單分(fēn)子測序試劑盒，以及貝瑞基因基于PacBio Sequel-II測序儀的(de)單分(fēn)子測序試劑盒。

值得(de)一提的(de)是，單分(fēn)子直接RNA測序在未來(lái)是一個(gè)很有潛力的(de)病原測序途徑。現在它的(de)準确率和(hé)讀長(cháng)仍和(hé)cDNA測序有一定距離，但是這(zhè)一方法可(kě)以直接測量病毒RNA堿基的(de)修飾（Viehweger et al, “Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis”）。我們期待在這(zhè)個(gè)方向上有更多(duō)的(de)成果來(lái)闡明(míng)RNA修飾在病毒中的(de)作用(yòng)。

2、新冠病毒的(de)核酸檢測

新冠病毒的(de)主流核酸檢測方法無疑是熒光(guāng)定量PCR，但這(zhè)裏我不贅述PCR的(de)技術細節。最近大(dà)家意見比較多(duō)的(de)一個(gè)問題就是熒光(guāng)PCR的(de)假陰性率高(gāo)，然後是操作時(shí)間過長(cháng)，最後是對(duì)于不同樣品的(de)敏感度。這(zhè)幾個(gè)問題跟癌症早篩面臨的(de)問題相似。假陰性和(hé)操作時(shí)間其實是互相矛盾的(de)。速度越快(kuài)，擴增效率越低，陽性率會越差。平心而論，熒光(guāng)PCR的(de)使用(yòng)還(hái)是非常成功的(de)。

核酸檢測的(de)假陰性問題雖然要盡量解決，但分(fēn)子診斷中由于檢測限和(hé)樣品質量問題出現假陰很難避免。導緻檢測錯誤出現的(de)因素是多(duō)方面的(de)，網絡上已有專業人(rén)士對(duì)此進行充分(fēn)的(de)技術普及，這(zhè)裏我隻想說一下(xià)病人(rén)樣品種類這(zhè)一點。最近深圳市第三人(rén)民醫院的(de)研究顯示，痰液樣品的(de)陽性率大(dà)大(dà)超過咽拭子這(zhè)樣的(de)固體樣品（Yang et al, ”Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infection”）。 在核酸檢測方法上，進一步優化(huà)樣品采集方式可(kě)能是最值得(de)做(zuò)的(de)工作。

其它檢測方法中，等溫擴增和(hé)免疫檢測雖然更快(kuài)，但特異性和(hé)檢測限相比于熒光(guāng)PCR沒有優勢；CT檢查則難以做(zuò)到規模化(huà)的(de)廣泛使用(yòng)。

這(zhè)次疫情對(duì)中國的(de)體外診斷行業是一個(gè)巨大(dà)的(de)考驗。爲了(le)幫助醫院盡快(kuài)診斷，做(zuò)好診斷，上百家企業在春節期間加班加點趕制檢測試劑盒和(hé)儀器。這(zhè)種“飽和(hé)式救援“保證了(le)節後的(de)試劑盒供應充足，也(yě)把整個(gè)産業鏈推到了(le)極限。我們應當對(duì)中國IVD行業整體的(de)快(kuài)速響應和(hé)努力付出感到自豪，同時(shí)也(yě)期待在以下(xià)方面能有更大(dà)的(de)提升：

1）核心原料的(de)産能和(hé)質量還(hái)要進一步提高(gāo)。

大(dà)部分(fēn)的(de)IVD公司都隻有設計試劑盒的(de)能力，而沒有提供試劑原料的(de)能力。這(zhè)些原料的(de)産量和(hé)質量對(duì)檢測試劑盒的(de)性能是至關重要的(de)，國内的(de)原料供應鏈企業在此次疫情中也(yě)暴露出了(le)極限生産時(shí)的(de)速度和(hé)供貨困難。如果一些IVD企業在擁有檢測方法的(de)同時(shí)也(yě)具備核心原料的(de)自主制備能力或産業鏈布局，可(kě)以期待它們能夠更從容地應對(duì)突發疫情，在趕進度的(de)同時(shí)保障試劑的(de)供應和(hé)質量。

2）快(kuài)速檢測的(de)技術儲備需要加強。

快(kuài)速檢測雖然不一定最準确，但是它對(duì)于基層醫療機構确實是有價值的(de)。現在這(zhè)些快(kuài)速檢測産品的(de)供應商大(dà)部分(fēn)都還(hái)是比較年輕的(de)公司，在當前的(de)競争中相比于PCR企業處于劣勢。但是幾年之後，他(tā)們可(kě)能就會像行業的(de)前輩們一樣積攢足夠的(de)商譽，像等溫擴增試劑檢測盒這(zhè)樣的(de)産品會得(de)到更多(duō)的(de)應用(yòng)。現在幾種主流的(de)核酸快(kuài)檢方法，如RPA、SHERLOCK和(hé)LOOP，都是試劑比較複雜(zá)的(de)體系。國内的(de)廠商大(dà)多(duō)需要自己做(zuò)試劑和(hé)儀器，而不是像PCR行業一樣有比較可(kě)靠的(de)産業鏈提供試劑，有通(tōng)用(yòng)的(de)PCR儀可(kě)以借助。可(kě)以預見，下(xià)一步核酸快(kuài)檢會得(de)到更多(duō)的(de)支持，類似于PCR的(de)産業鏈和(hé)通(tōng)用(yòng)儀器會形成，下(xià)一次傳染病危機中快(kuài)檢産品的(de)開發速度和(hé)質量都會提高(gāo)。

3、新冠之後的(de)病原測序

如上所述，測序對(duì)于病毒的(de)發現和(hé)研究（包括分(fēn)類，溯源，蛋白研究，疫苗開發）非常重要，但是在診斷中就沒有大(dà)量用(yòng)到測序。第一，畢竟測序太貴；第二，測序需要的(de)樣本量高(gāo)；第三，測序需要的(de)時(shí)間相對(duì)更長(cháng)。那麽這(zhè)次疫情之後測序儀在醫院的(de)應用(yòng)會不會加速？可(kě)以預期，具備測序儀制造能力的(de)企業都會推動其産品在病原測序方向的(de)報證，測序儀在醫院的(de)投放會增加，但也(yě)可(kě)以預計，隻有科研能力強的(de)醫院會真正做(zuò)病原變異和(hé)微生物(wù)宏基因組方面的(de)工作。大(dà)部分(fēn)三甲醫院主要還(hái)是用(yòng)更加簡便和(hé)快(kuài)速的(de)核酸檢測方法測已知病原，它們可(kě)能會更多(duō)的(de)把力量花在qPCR能力、快(kuài)速檢測設備以及生物(wù)安全防護能力的(de)提升上。而對(duì)于未知病原的(de)測序，将更多(duō)的(de)還(hái)是由CDC和(hé)中科院病毒所這(zhè)樣的(de)機構去實施。

那麽第三方檢測機構會不會購(gòu)買更多(duō)的(de)測序儀呢(ne)? 很有可(kě)能。以後可(kě)能會形成醫院做(zuò)常見病原的(de)PCR檢測、第三方檢驗機構做(zuò)疑難感染病原測序的(de)分(fēn)工。第三方檢驗機構的(de)測序一定要能夠給出一個(gè)廣譜的(de)病原鑒定結果。所以相應病原測序産品的(de)通(tōng)量要高(gāo)，病原數據庫要大(dà)。至于它是否有醫療器械證反而不一定很重要。廣譜病原檢測的(de)醫療器械證用(yòng)什(shén)麽标準審批也(yě)是一個(gè)問題。國家藥監局需要制定新的(de)規範和(hé)标準盤。

此次疫情以後，國家必定會采取一些措施防止疫情重現，提升抗疫能力。其中和(hé)測序相關的(de)一些可(kě)能的(de)舉措有：

 1）長(cháng)期監測傳染病高(gāo)發地點的(de)病原分(fēn)布，提前預警

這(zhè)包括海鮮市場(chǎng)，肉類批發市場(chǎng)，人(rén)群聚集場(chǎng)所這(zhè)些地點。疾控部門的(de)檢測會突破現有的(de)已知病原範疇，進入未知病原的(de)預警和(hé)疫苗目标的(de)預判工作。樣品可(kě)能會交由第三方檢驗機構進行測序。

2）追蹤病毒變異

曆史上強傳染性病原變異重現非常普遍。如2009H1N1流感病毒在美(měi)國爆發，變異後擴展到全球，一直到現在還(hái)會傳播 （Ref：https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/2009-h1n1-pandemic.html）。哪怕是比較小的(de)變異也(yě)可(kě)能會對(duì)病毒的(de)傳染性造成很大(dà)影(yǐng)響（Maurer-Stroh et al, “A new common mutation in the hemagglutinin of the 2009 (H1N1) influenza A virus”），因此疾控部門的(de)病原測序會成爲長(cháng)期的(de)工作。

3）加強儲備針對(duì)冠狀病毒的(de)藥物(wù)和(hé)疫苗技術

冠狀病毒給中國帶來(lái)了(le)SARS和(hé)COVID-19兩次大(dà)規模的(de)疫情，這(zhè)表明(míng)我國人(rén)群對(duì)冠狀病毒可(kě)能有一定的(de)易感性。因此，即使是在此次新冠疫情結束之後，也(yě)需要持續開展針對(duì)冠狀病毒的(de)藥物(wù)開發，尤其要對(duì)一些現有藥物(wù)做(zuò)進一步的(de)測試和(hé)評估，把它們推過安全性驗證階段，可(kě)能成爲未來(lái)抗疫立刻可(kě)用(yòng)的(de)武器。

在預防方面，針對(duì)冠狀病毒的(de)廣譜疫苗的(de)開發勢在必行，開發中必須繞開高(gāo)頻(pín)變異位點，兼顧相似病毒。

4）監測醫院病原環境，控制院内交叉感染

高(gāo)達40%的(de)院内傳染率（Wang et al, “Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus–Infected Pneumonia in Wuhan, China”）是造成這(zhè)次疫情擴大(dà)的(de)一大(dà)原因。曆史上病毒/細菌交叉感染也(yě)是重症的(de)一大(dà)來(lái)源，對(duì)醫院、社區(qū)診所的(de)定時(shí)病原監測很有意義。

不過這(zhè)不會是一件容易的(de)事。可(kě)以想象，由于醫院氣溶膠環境的(de)複雜(zá)性，測序檢出的(de)結果将是一個(gè)很長(cháng)的(de)微生物(wù)清單，如何從中得(de)到有效的(de)解讀将是一個(gè)不小的(de)挑戰。但我仍然認爲值得(de)去做(zuò)。我們現在所熟悉的(de)PM2.5指數也(yě)不是從來(lái)就有，但關注的(de)人(rén)多(duō)了(le)就會天天測，而且成爲污染治理(lǐ)的(de)一個(gè)标準。微生物(wù)測序也(yě)可(kě)以提供一個(gè)類似的(de)引導。此外，如果能開發出一種能夠直接從空氣中取氣溶膠病原樣品測序的(de)儀器，将會非常有價值。

以上僅是我對(duì)病原測序行業未來(lái)發展的(de)一些個(gè)人(rén)思考。作爲一名在基因行業裏超過20年的(de)從業者，我想說的(de)是，雖然此次新冠抗疫之戰使得(de)基因檢測技術成爲大(dà)衆矚目的(de)焦點，但最好的(de)技術并不是用(yòng)來(lái)赢得(de)戰“疫”，而是用(yòng)來(lái)防止戰“疫”的(de)出現。這(zhè)才是我們投身于基因科技的(de)初衷。

孫雷，CTO，真邁生物(wù)（GeneMind Biosciences）。1993年畢業于中國科學技術大(dà)學材料系，在美(měi)國矽谷具有二十年以上的(de)基因行業經曆。曾任美(měi)國太平洋生物(wù)（Pacific Biosciences）主任科學家兼高(gāo)級總監，Intel研究院Nanoparticle項目主任，GE Healthcare資深科學家。