近日，由中信湘雅生殖與遺傳專科醫院（以下(xià)簡稱“中信湘雅”）林(lín)戈課題組和(hé)深圳市中康聯大健康生物科技有限公司（以下(xià)簡稱“真邁生物(wù)”）聯合組成的(de)研究團隊在預印本服務網站BioRxiv在線發表了(le)題爲Accurate CNV identification from only a few cells with low GC bias in a single-molecule sequencing platform的(de)學術論文。
論文結果展示，團隊合作研發的(de)基于GenoCare單分(fēn)子測序儀的(de)微量細胞檢測方案在檢測靈敏度和(hé)時(shí)間上優于傳統NGS（Next generation sequencing）檢測方法，這(zhè)是我國自主開發的(de)單分(fēn)子測序平台首次應用(yòng)于單細胞及微量細胞研究領域的(de)案例，研究成果将進一步推動國産基因測序平台在未來(lái)臨床研究和(hé)應用(yòng)中的(de)廣泛普及。
在基于微量細胞進行拷貝數異常（CNV，Copy number variation）分(fēn)析的(de)科研及臨床診斷的(de)多(duō)種應用(yòng)中，NGS（Next generation sequencing）相比于傳統的(de)FISH（Fluorescence in situ hybridization）、aCGH（Array comparative genomic hybridization）芯片檢測等技術具有更高(gāo)的(de)檢測分(fēn)辨率和(hé)更大(dà)的(de)發展潛力。盡管已有的(de)NGS技術在這(zhè)一領域的(de)應用(yòng)已較爲成熟，但仍有改進和(hé)提升的(de)空間。
首先，由于獲取的(de)樣本細胞數極少，受限于二代測序平台對(duì)建庫起始量的(de)要求，必須在建庫前對(duì)樣本進行全基因組擴增（Whole Genome Amplification, WGA）。盡管WGA技術在不斷發展，其擴增過程中引入的(de)偏差仍會或多(duō)或少地影(yǐng)響檢測結果的(de)可(kě)靠性和(hé)靈敏度；其次，現有檢測方法建庫流程較爲複雜(zá)，導緻整體檢測周期較長(cháng)，一般來(lái)說從樣本制備到獲得(de)最終的(de)檢測結果至少需要2天的(de)時(shí)間。現有技術的(de)普及還(hái)受到成本較高(gāo)的(de)限制。
基于這(zhè)些亟待解決的(de)問題，中信湘雅聯合真邁生物(wù)共同研發出了(le)一套基于單分(fēn)子測序技術的(de)微量細胞CNV檢測體系，在保持檢測結果準确度的(de)同時(shí)提升染色體異常檢測的(de)靈敏度，大(dà)大(dà)降低檢測過程的(de)複雜(zá)度以及檢測成本。該研究團隊開發了(le)一種基于細胞直接裂解結合Tn5轉座酶系統的(de)建庫方法，可(kě)以跳過傳統意義上的(de)WGA步驟直接進行建庫，采用(yòng)該方法可(kě)對(duì)低至5個(gè)細胞進行直接裂解建庫，并成功在單分(fēn)子基因測序儀GenoCare 1600上完成了(le)測序和(hé)數據分(fēn)析。研究結果表明(míng)，相比于基于WGA的(de)建庫方法，該建庫方法具有明(míng)顯更低的(de)GC偏好（圖1）。
圖1 基于不同建庫方法的(de)GC 偏好對(duì)比
爲了(le)驗證該體系的(de)染色體異常檢測能力，該研究對(duì)6種帶有不同染色體微小結構變異的(de)細胞系進行了(le)檢測（其中最小的(de)染色體結構異常爲1.29M的(de)一段染色體缺失），并将單分(fēn)子測序系統的(de)分(fēn)析結果與二代測序平台Illumina HiSeq X Ten的(de)結果進行了(le)一緻性分(fēn)析。研究結果表明(míng)，該檢測體系的(de)分(fēn)析結果與基于二代測序平台的(de)分(fēn)析結果完全一緻，對(duì)低至1.29M的(de)染色體結構異常可(kě)準确檢出（圖2）。
圖2 基于GenoCare 1600與HiSeq X Ten的(de)CNV測序結果對(duì)比（染色體異常：46, XX, del(1p36.33-1p36.32) 1.29M）
在基于微量細胞爲研究樣品的(de)不同應用(yòng)場(chǎng)景中，嵌合一直是困擾科研人(rén)員(yuán)的(de)一個(gè)重要因素。如在植入前胚胎中，染色體非整倍體嵌合情況較爲常見。而不同類型和(hé)比例的(de)嵌合對(duì)臨床結局有一定影(yǐng)響。因此，對(duì)于少量細胞的(de)染色體非整倍體嵌合狀況進行準确檢測顯得(de)尤爲重要。根據國際植入前遺傳學診斷學會PGDIS（Preimplantation Genetic Diagnosis International Society）的(de)建議(yì)，高(gāo)于80%的(de)異常嵌合建議(yì)按非整倍體處理(lǐ)，低于20%的(de)異常嵌合建議(yì)按整倍體處理(lǐ)，介于20~80%之間的(de)異常嵌合可(kě)作爲臨床醫生的(de)參考，根據具體情況來(lái)選擇處理(lǐ)方案。該研究團隊同時(shí)對(duì)該檢測體系的(de)嵌合異常胚胎的(de)檢出效力進行了(le)評估，将正常細胞系gDNA與染色體異常細胞系gDNA按0%~100%的(de)不同比例進行混合模拟不同的(de)嵌合比率進行建庫測序檢測分(fēn)析。結果表明(míng)，該檢測體系可(kě)對(duì)低至20%的(de)異常嵌合成功檢出（圖3）。
圖3 基于GenoCare 1600的(de)微量細胞系CNVs檢測結果
（染色體異常：46, XY, dup(2p25.3-2p16.2) 53.26M，20%嵌合）
論文第一作者、中信湘雅胡亮博士表示，中信湘雅一直緻力于與國内同道共同推進植入前遺傳領域新技術的(de)研發、應用(yòng)和(hé)推廣。與現有檢測方法比較，本次基于Tn5轉座酶系統建庫并利用(yòng)GenoCare單分(fēn)子測序平台進行CNV檢測，在保持高(gāo)準确度的(de)同時(shí)，盡量減少了(le)WGA引起的(de)GC偏好性。另外，該策略的(de)檢測流程也(yě)比較簡單。
論文共同通(tōng)訊作者、真邁生物(wù)醫學研發總監張萌表示，作爲一種新的(de)平台方案，基于單分(fēn)子測序的(de)微量細胞檢測在靈敏度、時(shí)間和(hé)成本上都具有明(míng)顯的(de)優勢。期待這(zhè)種新的(de)方法能爲科研工作者的(de)研究提供一種新的(de)思路，我們也(yě)會通(tōng)過不斷的(de)測試和(hé)完善去推動它早日作爲一種篩查診斷方案應用(yòng)至臨床，造福更多(duō)的(de)普通(tōng)人(rén)。
據悉，中信湘雅與真邁生物(wù)将進一步完善實驗設計，适時(shí)開展相關基礎及臨床研究，以充分(fēn)驗證和(hé)推動單分(fēn)子基因測序技術的(de)廣泛應用(yòng)。
關于中信湘雅
中信湘雅生殖與遺傳專科醫院（原中南(nán)大(dà)學湘雅醫學院不孕與遺傳專科醫院）是現代化(huà)大(dà)型生殖與遺傳專科醫院，前身是中南(nán)大(dà)學湘雅醫學院人(rén)類生殖工程研究室門診部。
自1980年在我國醫學遺傳學奠基人(rén)盧惠霖教授的(de)指導下(xià)，盧光(guāng)琇教授在國内開展人(rén)類輔助生殖技術研究和(hé)臨床工作以來(lái)，先後于1988年被衛生部批準爲國家精子庫技術指導中心，2007年成爲衛生部公布的(de)人(rén)類輔助生殖技術和(hé)人(rén)類精子庫技術培訓基地，2017年成爲國家基因檢測技術應用(yòng)示範中心（湖南(nán)孕前診斷分(fēn)中心）。
醫院曆經30餘年的(de)探索和(hé)實踐，現已經發展成爲經衛生部審查批準，擁有湖南(nán)地區(qū)合格人(rén)類冷(lěng)凍精子庫的(de)三級生殖與遺傳專科醫院。2017年獲全國衛生計生系統先進集體榮譽稱号，同年獲湖南(nán)省創新獎。
關于真邁
真邁生物(wù)（GeneMind Biosciences）創立于2012年，總部現設于深圳羅湖，擁有辦公、研發和(hé)生産場(chǎng)地共8000餘平米。真邁生物(wù)專注于基因測序産業上遊設備和(hé)試劑的(de)研發制造，以自主開發的(de)第三代單分(fēn)子基因測序儀爲核心，具備從原料、試劑到設備、軟件的(de)全流程解決方案，是國際上屈指可(kě)數的(de)擁有自主基因測序儀品牌的(de)硬科技企業。
真邁全職團隊共100餘人(rén)，其中經政府認定的(de)“高(gāo)層次人(rén)才”占25%以上，海内外研究生學曆50%以上。公司擁有180餘項國内外專利授權和(hé)申請（包括中國、美(měi)國、歐洲等地區(qū)），17項計算(suàn)機軟件著作權，覆蓋基因測序平台的(de)“儀器-試劑-芯片-算(suàn)法-應用(yòng)”全流程模塊。
真邁生物(wù)擁有自主開發的(de)國産單分(fēn)子基因測序儀GenoCare及配套試劑盒，可(kě)無需擴增直接檢測DNA信息。目前，GenoCare已通(tōng)過醫療器械注冊檢驗，單分(fēn)子測序通(tōng)用(yòng)試劑盒已獲得(de)第一類醫療器械備案資質。同時(shí)，GenoCare單分(fēn)子基因測序儀等5項産品已獲得(de)歐盟CE标志，是首個(gè)獲得(de)歐盟CE标志的(de)國産第三代基因測序儀産品。